ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیك

ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیك

دسته بندی	پزشکی
فرمت فایل	doc
حجم فایل	6.068 مگا بایت
تعداد صفحات	186

ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیك

فهرست مطالب

عنوان صفحه

چكیده 1

مقدمه 3

فصل اول

1-1 – تالاسمی 8

1-2-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی 8

1-2-1 – خون شناسی 9

1-2-2- خون سازی و گلبولهای قرمز 10

1-3- تالاسمی و انواع آن 10

1-3-1 آلفا تالاسمی 10

1-3-2- بتا تالاسمی 11

1-3-2-1 بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل) 11

1-3-2-2 – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی) 12

1-3-2-3-بتا تالاسمی بینابینی 13

1-4- تشخیص تالاسمی 13

1-5- درمان تالاسمی 13

1-6- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان 14

1-6-1- مسمومیت حاد آهنی 15

1-7- دسفرال 16

1-7-1- نحوه استفاده از داروی دسفرال 17

1-7-2-كاربردهای داروی دسفرال در پزشكی 18

1-7-3- عوارض ناشی از داروی دسفرال 19

1-7-4- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال 19

1-7-5- ملاك توقف درمان بوسیله دسفرال 20

فصل دوم

2-1- سیدرو فورها 22

2-1-1- هیدروكسامات ها 24

2-1-2-فنولات ها یا كاتكولات ها 25

2-2- دسفری اكسامین ها 26

2- 2-1 – ساختمان دسفری اكسامین 28

2-2-2- دسفراكسامین بصورت آنتی اكسیدان 28

2-2-3 – خصوصیات فیزیكو و شیمیایی دسفراكسامین 29

2-2-4- مكانیسم دسفراكسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن 29

2-2-5- تشكیل رادیكال DFO nitroxide 30

2-3- دسفری اكسامین B 31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اكسامین B 33

2-3-2- ژنهای كد كننده دسفری اكسامین B 33

2-4- تولید كننده­های دسفری اكسامین 34

2-5- اهمیت آهن بر روی میكروارگانیسمها 35

2-6- مكانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میكروارگانیسمها 36

2-7- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اكسامین B 37

فصل سوم

3-1- اكتینومیست ها 40

3-2- استرپتومایسس ها 43

3-2-1- پاتولوژی 43

3-2-2 – مرفولوژی و ساختمان 43

3-2-3- مشخصات كلنی 454

3-2-4- اسپورزایی 47

3-2-5- تركیبات پوشش سلولی 49

3-2-6- تغذیه و فاكتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیكوشیمیایی 49

3-2-6-1- تغذیه 49

3-2-6-2- اكسیژن 50

3-2-6-3 – رطوبت 50

3-2-6-4- دما 51

3-2-6-5- pH 51

3-2-6-6- اكولوژی 52

3-2-6-7- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس 53

3-2-7- انواع فرآورده های میكروبی 56

3-2-7-1- متابولیت های اولیه 56

3-2-7-2- متابولیت های ثانویه 56

3-2-7-2-1- آنتی بیوتیك ها 58

3-2-7-2-1-1- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیك 58

3-2-7-3- آنزیمها 63

3-2-7-3-1- پروتئازها 63

3-2-7-3-1-1- پروتئازهای اسیدی 67

3-2-7-3-1-1-1- رنین 67

3-2-7-3-1-2- پروتئازهای خنثی 67

3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی 67

3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی 68

3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی 69

3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها 69

3-2-7-3-1-5- تجزیه 71

3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها 71

3-2-8- محیط كشت تخمیر صنعتی 71

3-2-8-1- نیازهای غذایی میكروارگانیسم‌ها 71

3-2-8-1-1- كربن 74

3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها 77

3-2-8-1-2-نیتروژن 78

3-2-8-1-2-1- منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها 80

3-2-8-1-3- هیدروژن و اكسیژن 80

3-2-8-1-4- مواد معدنی 80

3-2-8-2-تنظیم كننده های متابولیكی 81

3-2-8-3- ضد كف ها 82

3-2-9- بیوسنتز در استرپتومایسس ها 83

فصل چهارم

4-1- دستگاه های مورد استفاده 86

4-2- وسایل مورد استفاده 86

4-3 – محیط های كشت مایع برای رشد باكتری 88

4-4- محیط های كشت جامد برای رشد باكتری 89

4-5- محیط های جامد برای تولید اسپور 89

4-6- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم 90

4-7- مواد لازم جهت استفاده از میكروسكوپ نوری 91

4-8- محیط مورد استفاده جهت شناسایی كیفی دسفری اكسامین: محیط Des₄ 91

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اكسامین محیط Soy bean 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باكتری ها 92

4-11- معرف های دسفری اكسامین 92

4-12- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اكسامین B 92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اكسامین 92

4-14- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer 93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl 93

4-15- محلول كازئین %5/0 دربافر فسفات 93

4-15-1- بافر فسفات (PBS) 93

4-16- محلول لوری (Lowry) 93

فصل پنجم

5 – ١- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس 98

5 ـ ٢ ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیكی سویه استرپتومایسس پیلوسوس 98

5-٢-١- خصوصیات ماكروسكوپی 99

5- ٢-١-١- كشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد 99

5-٢-١-٢- كشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع 99

5-٢-٢ خصوصیات میكروسكوپی 99

5-٢-٢-١- تهیه لام از محیط كشت جامد 99

5-٢-٢-٢- تهیه لام از محیط كشت مایع 100

5ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آمیزی گرم 100

5 ـ ٣ـ تهیه مایع تلقیح 100

5 ـ ٣ـ ١ـ تهیه محیط ذخیره 101

5 ـ ٣ـ ٢ـ تهیه سوسپانسیون اسپور 101

5ـ ٤ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس 101

5ـ ٥ـ بررسی تغییرات pH در محیط كشت Soybean 102

5ـ ٦ـ تولید دسفری اكسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس 102

5ـ ٦ـ ١ـ تشخیص كیفی دسفری اكسامین 102

5ـ ٦ـ ٢ـ سنجش میزان تولید دسفری اكسامین در هر روز 103

5-6-3- رسم منحنی استاندارد دسفرال 103

5-٧ـ استخراج دسفری اكسامین بوسیله فنل-كلروفرم 104

5 ـ ٧ـ ١ـ مزتیله كردن دسفری اكسامین 105

5-8- تعیین وجود دسفری اكسامین B در ماده استخراج شده 105

5ـ ٩ـ بهینه سازی محیط كشت تولید دسفری اكسامین 107

5ـ ٩ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین 107

5 ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین در یك محدوده غلظت 107

5ـ ٩ـ ٢ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB₁) ( برتولید دسفری اكسامین 108

5 ـ ٩ـ ٣ـ بررسی گلوكز و ملاس و سوكروز بر تولید دسفری اكسامین 108

5ـ ٩ـ ٤ـ بررسی اثر شلاته كننده های كاتیون بر تولید دسفری اکسامین 108

5 ـ ٩ـ ٥ـ استفاده از محیط كشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط كشت Soybean 109

5 ـ ٩ـ ٦ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اكسامین 109

5 ـ٩ـ٦ـ١ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اكسامین 111

5 ـ ١٠ – بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته كننده ها و مواد معدنی مختلف 112

5 ـ ١٠ـ ١ـ كشت باكتری و سنجش پروتئاز 112

5 ـ ١٠ـ 2ـ تخلیص كازئین 113

فصل ششم

6ـ ١ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیكی ماكروسكوپی استرپتومایسس پیلوسوس 115

6ـ ١ـ ١­ـ خصوصیات ماكروسكوپی سویه استاندارد بر روی محیط كشت جامد 115

6 ـ ١ـ٢ـ خصوصیات ماكروسكوپی سویه استاندارد در محیط كشت مایع 115

6 ـ ٢ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیكی میكروسكوپی استرپتومایسس پیلوسوس 116

6 ـ٣ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط كشت MYB 116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط كشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس 118

6 ـ ٥ـ تشخیص كیفی و كمی دسفری اكسامین تولیدی 120

6-5-1- تشخیص كیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اكسامین 120

6ـ٥ـ2ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال 120

6ـ٥ـ3ـ میزان دسفری اكسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean 121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اكسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس 122

6-6-1- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اكسامین B در ماده استخراج شده 122

6-7- بهینه سازی محیط كشت تولید دسفری اكسامین 124

6-7-1 بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین 124

6-7-1-1- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اكسامین در یك محدوده غلظت 124

6ـ7ـ ٢ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B₁ ) 126

6 ـ 7ـ٣ـ بررسی گلوكز ، ملاس، سوكروز بر تولید دسفری اكسامین 126

6ـ 7ـ ٤ـ بررسی اثر شلاته كننده های كاتیون بر میزان تولید دسفری اكسامین 127

6ـ 7ـ ٥ـ استفاده از محیط كشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط كشت Soybean 128

6 ـ 7ـ ٦ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اكسامین 128

6 – 7 – 6 – 1 – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اكسامین 130

6ـ8ـ بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته‌كننده و مواد معدنی مختلف 139

فصل هفتم

– بحث و نتیجه گیری 143

– پیشنهادات 147

– فهرست منابع 149

چكیده

دسفری اكسامینB،‌ تنها سیدروفوری است كه فرم مزتیله آن (نمك متان سولفونات دسفری اكسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته كردن بار اضافی آهن، استفاده میگردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اكسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط كشت Soy bean كشت داده شد و دسفری اكسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- كلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیكی و افزایش بهره برداری از محصول مذكور از منابع كربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یك بر میزان دسفری اكسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید كه اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اكسامین تولیدی از سویه مذكور دارد و مقدار %125/0 ترئونین، در محیط كشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B₁)بررسی گردید و مشاهده شد كه تاثیر مثبت بر دسفر اكسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اكسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B₁) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته كننـده های كاتیونی EDTA، 8-hydroxyquinoline در محـیط كشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید كه شلاته كننده های مذكور اثر منفی بر تولید دسفری اكسامین دارند در نتیجه، كاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اكسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر

CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O ZnSO₄.7H₂O MnCl₂ FeSO₄.7H₂O

و همچنین اثرCaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O به طور همزمان در محیط كشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری كه كلسیم (بصورت CaCl₂.2H₂O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اكسامین تولیدی از سویه مذكور دارد و مقدار 8/2، و 2، CaCl₂.2H₂O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذكور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت كلسیم، بر تولید دسفری اكسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اكسامین تولیدی آشكار گردید بطوری كه غلظت ^2-10 × 4/0، ZnSO₄.7H₂O و 6/0، MgSO₄.7H₂O و 2، MnCl₂ سبب افزایش تولید دسفری اكسامین شد.

از طرفی استفاده همزمان CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O در محیط كشت Soy bean اثر منفی بر تولید دسفری اكسامین را نشان داد.

همچنین بررسی ها در مورد آهن (بصورت FeSO₄.7H₂O)‌ نشان داد كه افزایش غلظت آهن، سبب كاهش میزان دسفری اكسامین تولیدی گردید.

و اینگونه با استفاده از منابع نیتروژن و مواد معدنی مختلف بهینه سازی محیط كشت انجام گرفت و تولید دسفری اكسامین از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به میزان قابل ملاحظه ای افزایش یافت.

در این تحقیق، پروتئاز تولیدی از سویه استرپتومایسس پیلوسوس نیز بوسیله روش لوری (Lowry) اندازهگیری شد و اثر روی بصورت ZnSO₄.7H₂Oو آهن بصورت FeSO₄.7H₂O نیز بررسی گردید و مشاهده شد که افزایش غلظت روی، سبب افزایش پروتئاز تولیدی، از سویه مذکور گردید.

مقدمه

چه قدر زیبا و شاعرانه است كه انسان به نوای دلنواز عاشقانه‌ای كه در دل موجودات زنده نواخته می شود گوش دهد. تمام پدیده های هستی كه زائیده اراده و مشیت الهی هستند منظر شناخت خداوند قادرند و چه با شكوه است علمی كه انسان طالب معرفت را به سرچشمه شناخت این پدیده ها راهنمایی كند.

چشم دل بازكن كه جان بینی آنچه نادیدنی است آن بینی

امروزه عرصه ای از حیات بشری را نمی توان یافت كه تأثیر مثبت از بیوتكنولوژی نداشته باشد. كلمه بیوتكنولوژی كه از دو بخش بیو (به معنی زندگی و موجودات زنده) و تكنولوژی (به معنای هنر بشر در استفاده از علم) تشكیل شده است [10] بطور كلی بیوتكنولوژی به مفهوم استفاده از موجودات زنده، اندام ها و سلولهای آنها برای تولید یك فرآورده با خدمات با ارزش اقتصادی به منظور بهبودرفاه بشر می باشد. [10] بعبارت دیگر بیوتكنولوژی دانشی است كه در رابطه با استفاده از موجودات و متابولیتهای آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی، غذایی، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحث می كند. [14]

سرآغاز بیوتكنولوژی به ده هزار سال پیش برمی گردد. [10] روند تكاملی بیوتكنولوژی در طی هزاران سال شكل گرفته است، ولی بیوتكنولوژی مدرن در اواسط دهه 70 متولد شد. [14] از همان آغاز، بیوتكنولوژی در قالب مهندسی شیمی توسعه یافت، از این رو با توسعه ی فرآیندهای صنعتی، گستردگی بیشتری پیدا كرد. [14) بیوتكنولوژی از تكنیكهای مختلف ژنتیك، میكروبیولوژی كاربردی، شیمی، بیو شیمی، بیو لوژی، مهندسی فرآیند و غیره تشكیل می‌شود.[14]

ابزار توانمند بیوتكنولوژی در پزشكی، كشاورزی، حفاظت از محیط زیست انقلاب عظیمی را بوجود آورد و امیدی برای حل بسیاری از مشكلات حاد بشر در سده بیست و یكم است. [10]

بیوتكنولوژی علمی است كه بهترین راه برای یافتن علت بیماری ها و درمان آنها مورد استفاده قرار می‌گیرد بطوری كه در زمینه بهداشت تحولی عظیم ایجاد كرده است. [10] انتقال وبیان ژنهای موجودات زنده و نوتركیبی آنها در آزمایشگاه به تولید محصولاتی كه در پیشگیری و تشخیص و درمان بیماری ها كاربرد دارند از مهمترین عرصه های بكارگیری این دانش در توسعه ارتقاء سلامت و بهداشت جامعه و كنترل بیماری های عفونی و غیر عفونی می باشد. تشخیص دقیق و سریعتر بیماریها از جمله ناهنجاریهای ژنتیك و غربالگری از آنها، تشخیص پیش از تولد،استفاده از سلولهای بنیادین و سلولهای پایه و جنینی در مطالعات پایه و كاربردی پزشكی، تولید داروهای نوتركیب، تشخیص هویت، xenotransplantation با استفاده از حیوانات برای تولید بافت و اندام های مورد نیاز انسان، ژن درمانی و درمان بسیاری از بیماریهای صعب العلاج و تولید پروبیوتیك ها، بهبود كیفیت مواد غذایی و از همه مهم تر درك فرآیندهای زیستی عوامل بیماری زا، مكانیزم عمل آنها و تدبیر راهبردهای جدید بهداشت و درمان، تنها تعدادی از كارهای بیوتكنولوژی در عرصه بهداشت و پزشكی است.